Timeless Double Nickaseプラスミド (h): sc-404555-NIC

ヒトのTIMELESSは、DNA複製と概日時計および細胞周期の制御を連携させる、複製フォーク関連の保存因子であるTimelessをコードする。TimelessはTIPINやその他のレプリソーム構成因子と複合体を形成し、停止したフォークの安定化、ATR–CHK1チェックポイントの制御、適切なフォーク再開とS期進行の促進を通じた複製ストレスの抑制に関与する。これらの機能により、ゲノム完全性、クロマチンダイナミクス、DNA損傷応答にも影響を及ぼす。TIMELESSの制御異常は、文献においてチェックポイントシグナル伝達の変化やゲノム不安定性の表現型と関連づけられており、がん生物学やストレス応答の研究モデルで一般的に解析されている。

Timeless ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における TIMELESS 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、TIMELESS内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、TIMELESSの機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、TIMELESSが破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。