TERT Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423341-ACT

O gene Tert de camundongo codifica a transcriptase reversa da telomerase (TERT), o núcleo catalítico do ribonucleoproteíno da telomerase que alonga as repetições de DNA telomérico para preservar a integridade das extremidades cromossômicas. Ao contrariar o encurtamento dos telômeros durante a replicação do DNA, a TERT sustenta a vida útil replicativa, a estabilidade genômica e a progressão do ciclo celular, interagindo com a sinalização da resposta a danos no DNA e com programas de senescência. A regulação de Tert é central para a homeostase de células-tronco e progenitoras e é frequentemente alterada em contextos caracterizados por disfunção telomérica, incluindo fenótipos de envelhecimento precoce e modelos de tumorigenese nos quais a manutenção dos telômeros influencia a imortalidade celular. Modulações na expressão de Tert são, portanto, usadas para estudar a biologia dos telômeros, o controle cromatínico e transcricional no locus de Tert e a ativação de checkpoints induzidos por estresse.

TERT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tert sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TERT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tert em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tert, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TERT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tert nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TERT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TERT em células tumorais com expressão de Tert silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.