TCP-1 θ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404844-ACT

CCT8 codifica a subunidade TCP-1 teta (CCTθ) do complexo citosólico de chaperonina contendo TCP1 (TRiC/CCT), uma máquina de dobramento dependente de ATP essencial para a proteostase. O TRiC apoia a biogênese e a maturação conformacional de diversas proteínas cliente, incluindo componentes do citoesqueleto, como actina e tubulina, influenciando assim a organização do citoesqueleto, a progressão do ciclo celular e o controle de qualidade proteica adaptativo ao estresse. Por seu papel em manter a capacidade de dobramento, CCT8 está funcionalmente ligado a vias que regulam a estabilidade do proteoma, a integridade mitótica e as respostas celulares ao estresse proteotóxico. A atividade de chaperoninas desregulada tem sido associada a programas alterados de crescimento e sobrevivência na biologia do câncer e a processos de mau dobramento proteico relevantes para fenótipos neurodegenerativos, tornando CCT8 um nó útil para estudos mecanísticos de proteostase.

TCP-1 θ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCT8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TCP-1 θ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCT8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCT8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TCP-1 θ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCT8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TCP-1 θ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TCP-1 θ em células tumorais com expressão de CCT8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.