TBC1D24 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404561-ACT

O TBC1D24 codifica uma proteína que contém um domínio TBC, implicada na regulação do tráfego de membranas e da dinâmica vesicular, processos que sustentam a função sináptica e outras vias secretórias de alta demanda. Embora seu domínio TBC seja atípico em comparação com as proteínas canônicas ativadoras de GTPase Rab (Rab GAPs), o TBC1D24 tem sido associado ao controle da triagem endossomal, ao ciclo de vesículas sinápticas e à manutenção da homeostase celular sob estresse oxidativo. Em neurônios, essas vias se cruzam com a sinalização dependente de atividade e com a renovação de organelas, influenciando a excitabilidade e a estabilidade das redes neurais. A variação genética em TBC1D24 está associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e epilépticos, o que motiva estudos mecanísticos sobre efeitos dependentes de dose e de contexto em modelos celulares relevantes.

TBC1D24 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TBC1D24 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TBC1D24 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TBC1D24 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TBC1D24, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TBC1D24. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TBC1D24 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TBC1D24 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TBC1D24 em células tumorais com expressão de TBC1D24 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.