TASK-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403477-ACT

KCNK3 codifica o canal de potássio de dois poros TASK-1, uma condutância basal de “fuga” de K+ que ajuda a definir o potencial de membrana em repouso e regula a excitabilidade celular. O TASK-1 é sensível ao pH extracelular e é modulado por sinalização acoplada a GPCR, incluindo vias dependentes de PLC/PKC, acoplando assim a atividade dos receptores à polarização da membrana e à entrada de Ca2+. Em tecidos excitáveis como coração, cérebro e músculo liso, o TASK-1 influencia a repolarização do potencial de ação e os padrões de disparo, com efeitos a jusante sobre o manejo de cálcio e o tônus contrátil. A atividade desregulada de KCNK3/TASK-1 tem sido associada a alterações na eletrofisiologia cardiopulmonar e a fenótipos neurofisiológicos, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de canalopatias e sinalização de membrana.

TASK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TASK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TASK-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TASK-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TASK-1 em células tumorais com expressão de KCNK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.