SRY Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404342-ACT

SRY (sex-determining region Y) codifica un fattore di trascrizione con dominio HMG (high-mobility group) che avvia la determinazione del sesso maschile dirigendo la differenziazione delle cellule del Sertoli e lo sviluppo dei testicoli durante l’embriogenesi. SRY si lega al DNA e ne induce una curvatura per regolare programmi di espressione genica, attivando in particolare SOX9 e coordinando le vie a valle di differenziazione gonadica che modellano lo sviluppo dell’apparato riproduttivo. Un’espressione deregolata di SRY o variazioni di sequenza sono associate a disturbi dello sviluppo sessuale, inclusi disgenesia gonadica e fenotipi di inversione del sesso, e SRY è anche utilizzato come marcatore di linea cellulare e specifico per sesso in diversi contesti sperimentali. Poiché SRY agisce come regolatore maestro, modularne l’attività offre un modo diretto per interrogare le reti trascrizionali che controllano le decisioni di destino cellulare.

SRY Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SRY senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SRY Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SRY nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SRY, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SRY. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SRY nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SRY nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SRY nelle cellule tumorali con espressione di SRY silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.