SRPK1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423158-ACT

Il gene murino Srpk1 codifica la serina/arginina-rich protein-specific kinase 1 (SRPK1), un regolatore chiave dello splicing del pre-mRNA tramite la fosforilazione dei fattori di splicing SR e la modulazione dell’assemblaggio dello spliceosoma. SRPK1 influenza il processamento dell’mRNA, lo shuttling nucleo–citoplasma dei regolatori dello splicing e i programmi di isoforme trascrittomiche a valle che incidono sul controllo del ciclo cellulare, sulle risposte allo stress e sulla differenziazione. Un’attività alterata di SRPK1 è stata associata a pattern di splicing dell’RNA deregolati osservati in contesti di biologia del cancro, neurodegenerazione e segnalazione infiammatoria. Queste proprietà rendono SRPK1 un nodo utile per interrogare il rimodellamento di vie dipendenti dallo splicing e le reti di espressione genica nei sistemi dei mammiferi.

SRPK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Srpk1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SRPK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Srpk1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Srpk1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SRPK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Srpk1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SRPK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SRPK1 nelle cellule tumorali con espressione di Srpk1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.