SphK2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417921-ACT

O SPHK2 humano codifica a esfingosina quinase 2 (SphK2), uma quinase lipídica que fosforila a esfingosina para gerar esfingosina-1-fosfato (S1P), um mediador de sinalização pleiotrópico que influencia a sobrevivência celular, as respostas ao estresse, a migração e a sinalização inflamatória. A atividade da SphK2 afeta o equilíbrio do “reostato” dos esfingolipídios entre ceramidas/esfingosina pró-apoptóticas e S1P pró-sobrevivência, ligando-a à função mitocondrial, à sinalização nuclear e a processos associados à cromatina. Por meio da regulação de pools intracelulares de S1P e de vias a jusante, incluindo MAPK/ERK, PI3K-AKT e programas relacionados a NF-κB, o SPHK2 contribui para o controle dependente do contexto da proliferação e da modulação imune. A desregulação do metabolismo de esfingolipídios envolvendo SPHK2 tem sido associada à biologia do câncer, a mecanismos ligados à neuroinflamação e à neurodegeneração, e a vias de estresse cardiometabólico, sustentando seu uso em estudos mecanísticos de sinalização e homeostase lipídica.

SphK2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPHK2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SphK2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPHK2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPHK2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SphK2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPHK2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SphK2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SphK2 em células tumorais com expressão de SPHK2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.