SP-lyase Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422908-ACT

O gene murino **Sgpl1** codifica a liase de esfingosina-1-fosfato (S1P), uma enzima associada ao retículo endoplasmático que degrada irreversivelmente a S1P, encerrando a sinalização na rede metabólica dos esfingolipídios. Ao controlar os níveis intracelulares e extracelulares de S1P, a liase de S1P influencia a reostase lipídica e vias a jusante que regulam a sobrevivência celular, respostas ao estresse, migração e o tráfego de células imunes. Alterações na atividade de **SGPL1** perturbam o eixo ceramida–esfingosina–S1P e têm sido associadas a fenótipos inflamatórios, desregulação metabólica e patobiologia neuro-renal em sistemas modelo. Por isso, este gene é amplamente utilizado para investigar o fluxo de esfingolipídios, a sinalização de barreira/vascular e mecanismos de homeostase imune.

SP-lyase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Sgpl1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SP-lyase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Sgpl1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Sgpl1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SP-lyase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Sgpl1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SP-lyase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SP-lyase em células tumorais com expressão de Sgpl1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.