SNARK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405079-ACT

O NUAK2 humano codifica a SNARK (NUAK family SNF1-like kinase 2), uma quinase de serina/treonina relacionada à AMPK que integra o estado energético celular com a remodelação do citoesqueleto, a adesão e a sinalização adaptativa ao estresse. A atividade da SNARK tem sido associada à regulação da migração e invasão celulares, a programas ligados à transição epitélio–mesênquima e ao controlo dependente do contexto da sobrevivência sob estresse metabólico, com interseções com vias a jusante de LKB1 e com moduladores da sinalização de AKT/mTOR e TGF-β. Alterações na expressão ou na sinalização de NUAK2/SNARK foram relatadas em múltiplos contextos tumorais e em estados fibróticos e inflamatórios, em consonância com papéis na remodelação tecidual e nas respostas ao estresse. Essas propriedades tornam o NUAK2 um nó relevante para estudar a regulação, mediada por quinases, da motilidade, do metabolismo e da adaptação transcricional em modelos de células humanas.

SNARK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NUAK2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SNARK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NUAK2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NUAK2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SNARK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NUAK2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SNARK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SNARK em células tumorais com expressão de NUAK2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.