Plasmide CRISPR/Cas9 KO SmarcAL1 (h): sc-405681

Présentation

SMARCAL1 (SmarcAL1) code une hélicase d’appariement dépendante de l’ATP de la famille SNF2, qui se lie à l’ADN simple brin recouvert de la protéine A de réplication (RPA) et favorise l’inversion de la fourche, la migration de branche et la restauration des fourches de réplication bloquées. Elle intervient dans les réponses au stress réplicatif et le maintien du génome en se coordonnant avec les voies de signalisation et de réparation des dommages à l’ADN afin de limiter les recombinaisons aberrantes et les cassures chromosomiques. Par ces activités, SMARCAL1 contribue à préserver le calendrier de réplication et l’intégrité de la chromatine pendant la phase S. L’altération de SMARCAL1 est associée à des phénotypes d’instabilité génomique et présente un intérêt pour l’étude des mécanismes à l’origine de la dysplasie immuno-osseuse de Schimke ainsi que des vulnérabilités liées au stress réplicatif dans les cellules humaines.

Le SmarcAL1 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène SMARCAL1 dans les lignées cellulaires human. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus SMARCAL1, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le SmarcAL1 plasmide HDR (h) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible SMARCAL1 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide SmarcAL1 CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert SMARCAL1.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus SMARCAL1 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons SMARCAL1 essentiels à la fonction SmarcAL1
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.