SEMA3D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403924-ACT

SEMA3D codifica la semaforina 3D, un segnale guida secreto che trasduce attraverso complessi recettoriali di neuropiline e plessine per regolare il rimodellamento del citoscheletro, la migrazione cellulare direzionale e l’orientamento degli assoni. Nei tessuti umani, SEMA3D contribuisce alla patterning tissutale e all’organizzazione delle reti vascolari e neurali modulando l’attività delle GTPasi della famiglia Rho e l’adesione dipendente dalle integrine. Una segnalazione delle semaforine deregolata è associata ad alterazioni della motilità cellulare e delle interazioni con il microambiente osservate in vari disturbi dello sviluppo e in processi legati al cancro, rendendo SEMA3D un nodo utile per lo studio di invasione, angiogenesi e cablaggio neurale. I ricercatori analizzano comunemente la funzione di SEMA3D in vie che governano la segnalazione di guida, le dinamiche epitelio–mesenchimali e la regolazione dipendente dal contesto delle risposte a fattori di crescita e matrice extracellulare.

SEMA3D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SEMA3D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SEMA3D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SEMA3D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SEMA3D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SEMA3D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SEMA3D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SEMA3D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SEMA3D nelle cellule tumorali con espressione di SEMA3D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.