Plasmide CRISPR d'Activation (h) Selenoprotein I: sc-408993-ACT

SELENOI humain code la sélénoprotéine I, une enzyme localisée dans le réticulum endoplasmique (RE) qui agit comme une phosphotransférase de l’éthanolamine, catalysant une étape clé de la biosynthèse de novo de la phosphatidyléthanolamine. En contrôlant la composition des phospholipides membranaires, SELENOI influence l’homéostasie du RE, le trafic vésiculaire et des processus de signalisation dépendants des lipides qui façonnent les réponses cellulaires au stress ainsi que la fonction des organites. Des perturbations du métabolisme des phospholipides à éthanolamine ont été associées à des modifications de la dynamique membranaire et de la communication mitochondrie–RE, des processus pertinents pour la neurobiologie et la régulation métabolique. En tant que sélénoprotéine, SELENOI s’inscrit également dans des voies sensibles à l’état rédox via la biologie du sélénium et le contrôle qualité des protéines associé au RE.

Selenoprotein I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SELENOI sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Selenoprotein I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SELENOI dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SELENOI, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Selenoprotein I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SELENOI natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Selenoprotein I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Selenoprotein I dans les cellules tumorales présentant une expression de SELENOI silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.