SDF-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404598-ACT

SDF2 codifica o fator 2 derivado de células estromais (SDF-2), uma proteína residente no retículo endoplasmático (RE) implicada na homeostase da via secretora e no controle de qualidade de proteínas. O SDF-2 está associado à sinalização de estresse do RE e a respostas adaptativas que sustentam o dobramento, a maturação e o tráfego adequados de proteínas clientes no sistema secretor inicial. Por sua ligação à proteostase e a processos relacionados à resposta a proteínas mal dobradas (UPR), alterações na atividade de SDF2 são relevantes para fenótipos celulares observados em condições nas quais a função do RE e a secreção estão comprometidas, incluindo a adaptação ao estresse associada ao câncer e microambientes inflamatórios. Modificar a expressão de SDF2 é, portanto, útil para dissecar como a proteostase do RE se conecta a saídas de sinalização que influenciam a sobrevivência celular, a diferenciação e a capacidade secretora.

SDF-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SDF2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SDF-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SDF2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SDF2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SDF-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SDF2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SDF-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SDF-2 em células tumorais com expressão de SDF2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.