SARA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403648-ACT

ZFYVE9 codifica SARA (Smad Anchor for Receptor Activation), una proteina scaffold endosomiale con dominio FYVE che lega il fosfatidilinositolo 3-fosfato e coordina la trasduzione del segnale dipendente dal traffico vescicolare. SARA recluta SMAD2/3 ai recettori del TGF‑β attivati, promuovendo la fosforilazione delle SMAD e programmi trascrizionali a valle che regolano la transizione epitelio‑mesenchimale, il rimodellamento della matrice extracellulare e la modulazione immunitaria. Grazie al suo ruolo nella segnalazione TGF‑β/SMAD associata agli endosomi e al crosstalk con la dinamica di membrana dipendente da PI3K, SARA contribuisce a determinare le decisioni sul destino cellulare e l’omeostasi tissutale. La disregolazione dei componenti della via del TGF‑β, inclusi il reclutamento alterato delle SMAD e l’ampiezza del segnale, è implicata in fibrosi, progressione tumorale e disturbi dello sviluppo, a sostegno di ZFYVE9 come nodo meccanicistico per ricerche mirate sulla via.

SARA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZFYVE9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SARA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZFYVE9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZFYVE9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SARA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZFYVE9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SARA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SARA nelle cellule tumorali con espressione di ZFYVE9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.