Plásmido CRISPR de Activación (h) RUFY4: sc-405000-ACT

RUFY4 (RUN and FYVE domain containing 4) codifica una proteína adaptadora citosólica implicada en eventos de tráfico de membranas que acoplan la señalización de pequeñas GTPasas con la dinámica endosomal. A través de sus características RUN y relacionadas con FYVE de unión a lípidos, RUFY4 se asocia con el transporte vesicular, la organización de endosomas y lisosomas, y el control espacial del direccionamiento de receptores y carga, lo que puede influir en las salidas de señalización de la inmunidad innata. Los patrones de expresión y las conexiones con vías sugieren funciones en la biología de células mieloides e inmunitarias, incluidos procesos que moldean la inflamación y el manejo de antígenos. Las redes de tráfico y de señalización inmunitaria desreguladas en las que participa RUFY4 son relevantes para estudios de biología de infecciones, trastornos inflamatorios e interacciones tumor–inmunidad, donde la regulación endosomal puede afectar la activación de vías aguas abajo.

RUFY4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RUFY4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RUFY4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RUFY4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RUFY4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RUFY4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RUFY4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RUFY4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RUFY4 en células tumorales con expresión de RUFY4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.