Rrn3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403709-ACT

O RRN3 humano codifica o fator de iniciação da transcrição pela RNA polimerase I Rrn3 (também conhecido como TIF-IA), um regulador central da síntese de RNA ribossômico e da função nucleolar. O Rrn3 faz a ponte entre a Pol I e fatores ligados ao promotor para permitir a transcrição do pré-rRNA e sustenta a biogênese de ribossomos, acoplando assim as demandas de crescimento celular à capacidade de síntese proteica. Sua atividade é rigidamente controlada por vias de sinalização de nutrientes e crescimento, incluindo mTOR e MAPK/ERK, por meio de regulação pós-traducional que modula a competência de iniciação da Pol I. A transcrição desregulada pela Pol I e o estresse nucleolar associados à alteração da função de RRN3 são relevantes para a biologia proliferativa e para respostas celulares ao estresse, frequentemente estudadas em contextos de câncer e de sinalização metabólica.

Rrn3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RRN3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rrn3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RRN3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RRN3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rrn3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RRN3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rrn3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rrn3 em células tumorais com expressão de RRN3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.