RPA 32 kDa subunit Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401249-ACT

RPA2 codifica a subunidade de 32 kDa da proteína A de replicação (RPA), um complexo heterotrimérico essencial de ligação a DNA de fita simples, que estabiliza intermediários de ssDNA durante a replicação, recombinação e reparo do DNA. Ao coordenar a ativação de checkpoints e o recrutamento de nucleases, helicases e polimerases de reparo, a RPA2 sustenta a sinalização de estresse replicativo dependente de ATR e preserva a integridade da forquilha de replicação durante a fase S. A função de RPA2 está intimamente ligada a vias de manutenção do genoma, incluindo o reparo por excisão de nucleotídeos, a recombinação homóloga e redes de resposta a danos no DNA que previnem o acúmulo de mutações. A desregulação da atividade do complexo RPA e da tolerância ao estresse replicativo tem sido associada a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia do câncer e outros distúrbios de reparo do DNA.

RPA 32 kDa subunit O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RPA2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RPA 32 kDa subunit O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RPA2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RPA2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RPA 32 kDa subunit. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RPA2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RPA 32 kDa subunit no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RPA 32 kDa subunit em células tumorais com expressão de RPA2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.