RNF213 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418450-ACT

RNF213 codifica una grande E3 ubiquitina ligasi con dominio RING e attività ATPasica AAA+ che contribuisce alla proteostasi ubiquitina-dipendente e al rimodellamento, in risposta allo stress, della segnalazione cellulare. Nelle cellule umane, RNF213 è stato collegato alla regolazione di programmi di immunità innata e infiammatori, comprese le risposte associate all’interferone, e al controllo di processi vascolari e angiogenici attraverso la modulazione del turnover proteico e il crosstalk tra vie di segnalazione. La variabilità genetica e l’alterata espressione di RNF213 sono state associate a fenotipi cerebrovascolari e vasculopatici, inclusa la malattia di moyamoya, e il gene è stato studiato in contesti legati alla funzione endoteliale e all’attivazione immunitaria. Queste proprietà rendono RNF213 un bersaglio rilevante per analizzare la segnalazione mediata dall’ubiquitina, la biologia vascolare e i meccanismi molecolari dell’infiammazione in modelli cellulari pertinenti alla malattia.

RNF213 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF213 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF213 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF213 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF213, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF213. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF213 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF213 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF213 nelle cellule tumorali con espressione di RNF213 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.