Plásmido CRISPR de Activación (h) RNase III Drosha: sc-401639-ACT

DROSHA codifica la endonucleasa RNasa III Drosha, un componente central del complejo nuclear Microprocessor que inicia la biogénesis canónica de microARN al escindir los transcritos primarios de miARN en miARN precursores. Mediante su cooperación con DGCR8 y el procesamiento posterior por DICER, Drosha regula programas de silenciamiento génico posranscripcional que moldean el control del ciclo celular, la diferenciación, las respuestas al estrés y la señalización innata. La alteración del procesamiento de miARN dependiente de DROSHA se ha relacionado con una desregulación generalizada del transcriptoma y con cambios en las vías de daño del ADN y apoptosis. La actividad o expresión aberrante de Drosha se asocia con fenotipos moleculares observados en múltiples contextos de cáncer y trastornos del desarrollo, lo que respalda su uso como nodo mecanístico para estudiar redes de ARN no codificante.

RNase III Drosha El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DROSHA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RNase III Drosha El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DROSHA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DROSHA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RNase III Drosha. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DROSHA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RNase III Drosha en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RNase III Drosha en células tumorales con expresión de DROSHA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.