RNase III Drosha Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401639-ACT

DROSHA codifica a endonuclease RNase III Drosha, um componente central do complexo nuclear Microprocessor que inicia a biogênese canônica de microRNAs ao clivar transcritos primários de miRNA em miRNAs precursores. Por meio de sua cooperação com DGCR8 e do processamento a jusante por DICER, Drosha regula programas de silenciamento gênico pós-transcricional que moldam o controle do ciclo celular, a diferenciação, as respostas ao estresse e a sinalização inata. Alterações no processamento de miRNAs dependente de DROSHA têm sido associadas a uma desregulação ampla do transcriptoma e a mudanças em vias de dano ao DNA e apoptose. Atividade ou expressão aberrante de Drosha está associada a fenótipos moleculares observados em múltiplos contextos de câncer e distúrbios do desenvolvimento, sustentando seu uso como um nó mecanístico para o estudo de redes de RNAs não codificantes.

RNase III Drosha O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DROSHA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNase III Drosha O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DROSHA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DROSHA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNase III Drosha. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DROSHA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNase III Drosha no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNase III Drosha em células tumorais com expressão de DROSHA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.