RhoA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400052-ACT

RHOA codifica a pequena GTPase RhoA, um regulador central da dinâmica do citoesqueleto de actina que coordena a formação de fibras de estresse, a renovação de adesões focais e a contratilidade actomiosina. Por meio do ciclo entre os estados ligados a GDP e a GTP e da sinalização para efetores como ROCK e mDia, a RhoA integra sinais de GPCRs, receptores tirosina-quinase e integrinas para controlar a forma celular, a migração, a citocinese e a integridade das junções. A atividade de RhoA cruza-se com programas transcricionais Rho/ROCK e SRF/MRTF e com vias de mecanotransdução que influenciam proliferação e diferenciação. A sinalização desregulada de RHOA e mutações recorrentes têm sido associadas a fenótipos alterados de motilidade e adesão celular na biologia do câncer, bem como a contextos de disfunção imune e vascular, reforçando sua ampla relevância em redes de sinalização associadas a doenças.

RhoA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RHOA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RhoA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RHOA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RHOA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RhoA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RHOA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RhoA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RhoA em células tumorais com expressão de RHOA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.