Rb Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400116-ACT

O RB1 humano codifica a proteína do retinoblastoma (Rb), um supressor tumoral central que governa o checkpoint G1/S ao se ligar a fatores de transcrição E2F e coordenar a expressão de genes do ciclo celular. A atividade de Rb é regulada pela fosforilação mediada por ciclina D–CDK4/6 e ciclina E–CDK2, conectando a sinalização mitogênica à entrada na replicação do DNA, ao remodelamento da cromatina e a programas de diferenciação. Além do controle do ciclo celular, o RB1 influencia a estabilidade do genoma, a senescência e a repressão transcricional por meio de interações com modificadores de histonas e complexos SWI/SNF. A disrupção da sinalização da via de RB1 está amplamente associada à proliferação desregulada e é frequentemente implicada em cânceres e outros distúrbios proliferativos, tornando o RB1 um nó-chave para estudos mecanísticos do controle do ciclo celular.

Rb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rb. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rb no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rb em células tumorais com expressão de RB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.