RANK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400559-ACT

TNFRSF11A codifica o RANK, um membro da superfamília de receptores de TNF que atua como um nó central de sinalização no controle, dependente de RANKL, da diferenciação, ativação e sobrevivência de osteoclastos. Após a ligação do ligante, o RANK recruta proteínas adaptadoras como as TRAFs para iniciar a sinalização canônica e não canônica de NF-κB, cascatas de MAPK e programas transcricionais dependentes de AP-1/NFATc1. Essas vias integram sinais do microambiente ósseo e do sistema imune, conectando a atividade de RANK à osteoimunologia e à regulação da expressão de genes inflamatórios. A desregulação da sinalização de RANK tem sido associada a fenótipos anormais de remodelação óssea e a alterações na função de células imunes, tornando o TNFRSF11A um alvo amplamente utilizado em estudos mecanísticos de biologia esquelética e inflamatória.

RANK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TNFRSF11A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RANK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TNFRSF11A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TNFRSF11A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RANK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TNFRSF11A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RANK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RANK em células tumorais com expressão de TNFRSF11A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.