Plásmido CRISPR de Activación (m2) RAGE: sc-419040-ACT-2

El gen murino Ager codifica el receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE), un receptor multiligando de reconocimiento de patrones de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se une a AGEs, proteínas S100, HMGB1 y ligandos asociados al amiloide para amplificar la señalización de estrés celular. La activación de RAGE promueve la transcripción dependiente de NF-κB, la activación de las vías MAPK y JAK/STAT, la generación de especies reactivas de oxígeno y una expresión sostenida de genes inflamatorios que puede influir en la activación endotelial, el reclutamiento de leucocitos y la remodelación tisular. En sistemas murinos, la biología de Ager/RAGE se estudia con frecuencia en contextos de inflamación metabólica, disfunción vascular, neuroinflamación y procesos relacionados con la fibrosis, donde convergen la acumulación de ligandos y la señalización crónica de la inmunidad innata. La edición génica de Ager en células o modelos de ratón permite el análisis mecanístico de la señalización específica de cada ligando, la comunicación cruzada del receptor con los receptores tipo Toll y los programas transcripcionales posteriores relevantes para tejidos inmunitarios y de barrera.

RAGE El plásmido de activación CRISPR (m2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ager sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RAGE El plásmido de activación CRISPR (m2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ager en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ager, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RAGE. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ager y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RAGE en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RAGE en células tumorales con expresión de Ager silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.