R1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401712-ACT

O RRM1 humano codifica a subunidade catalítica R1 da redutase de ribonucleótidos, a enzima limitante da velocidade na síntese de desoxirribonucleótidos de novo, necessária para a replicação e a reparação do DNA. A R1 associa-se a RRM2 ou RRM2B para manter equilibrados os reservatórios de dNTPs, ligando o metabolismo de nucleótidos à progressão da fase S, às respostas ao stresse replicativo e às vias de estabilidade do genoma. A atividade desregulada de RRM1 pode alterar a tolerância a danos no DNA e a carga mutacional, tornando-a relevante para estudos de sinalização proliferativa, assinaturas quimio-genómicas de resposta e mecanismos de manutenção do genoma no cancro e noutras doenças caracterizadas por stresse replicativo.

R1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RRM1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

R1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RRM1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RRM1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de R1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RRM1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de R1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via R1 em células tumorais com expressão de RRM1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.