PR3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402550-ACT

PRTN3 codifica a proteinase 3 (PR3), uma protease serina de neutrófilos armazenada em grânulos azurofílicos e mobilizada para fagossomos e para a superfície celular durante a ativação da imunidade inata. A PR3 contribui para a defesa antimicrobiana e para a sinalização inflamatória por meio do processamento proteolítico de componentes da matriz extracelular, citocinas e redes de quimiocinas, interagindo com vias de desgranulação, formação de NETs e tráfego de leucócitos. A atividade desregulada da PR3 e o reconhecimento imune aberrante estão associados a lesão tecidual inflamatória e constituem importantes leituras mecanísticas em estudos de patologia mediada por neutrófilos, incluindo processos vasculíticos autoimunes. Assim, a dinâmica de expressão de PRTN3 é frequentemente investigada em modelos de diferenciação mieloide, ensaios de sinalização inflamatória e mapeamento de vias protease–substrato.

PR3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRTN3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PR3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRTN3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRTN3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PR3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRTN3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PR3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PR3 em células tumorais com expressão de PRTN3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.