POU3F4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404989-ACT

POU3F4 codifica um fator de transcrição do tipo domínio POU que regula programas de expressão gênica específicos de tipos celulares durante o desenvolvimento embrionário, com papéis proeminentes na padronização do neuroectoderma e na morfogênese do ouvido interno. Ao se ligar a motivos octâmeros e cooperar com cofatores, o POU3F4 ajuda a coordenar redes transcricionais que moldam a diferenciação neuronal e a organização do epitélio sensorial. A interrupção ou desregulação de POU3F4 está associada a formas hereditárias de perda auditiva e a malformações congênitas do ouvido interno, tornando-o um alvo útil para estudar a regulação gênica no desenvolvimento. Em modelos baseados em células, a modulação da expressão de POU3F4 permite investigar a especificação de linhagem, o controle transcricional dependente de cromatina e os circuitos de alvos downstream relevantes para fenótipos auditivos e neurais.

POU3F4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POU3F4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

POU3F4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POU3F4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POU3F4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de POU3F4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POU3F4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de POU3F4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via POU3F4 em células tumorais com expressão de POU3F4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.