podoplanin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420632-ACT

O gene Pdpn de camundongo codifica a podoplanina, uma glicoproteína transmembrana do tipo mucina expressa em células endoteliais linfáticas, células reticulares fibroblásticas e compartimentos epiteliais selecionados, onde regula a forma celular, a adesão e a motilidade direcional. A podoplanina interage com o receptor plaquetário CLEC-2 para influenciar a remodelação do citoesqueleto por meio da sinalização RhoA/ROCK e coordena dinâmicas de actina importantes para a linfangiogênese, a organização tecidual e a formação de redes estromais. No microambiente tumoral, células estromais e tumorais PDPN-positivas têm sido associadas a comportamento invasivo, remodelação da matriz extracelular e alterações no tráfego de células imunes. A expressão desregulada de PDPN também está associada a remodelação inflamatória e a vias relevantes para fibrose, tornando-a um alvo útil para estudos mecanísticos de biologia vascular e estromal.

podoplanin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Pdpn sem alterar a sequência de ADN subjacente.

podoplanin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Pdpn em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Pdpn, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de podoplanin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Pdpn nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de podoplanin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via podoplanin em células tumorais com expressão de Pdpn silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.