plakophilin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403577-ACT

PKP1 codifica la plakofillina 1, una proteina con ripetizioni armadillo che si localizza nei desmosomi e sostiene l’adesione cellula-cellula calcio-dipendente stabilizzando i complessi caderina desmosomiale–plakoglobina e collegando le placche giunzionali ai filamenti intermedi. Questa attività di “scaffold” contribuisce a mantenere l’integrità dell’epitelio, la funzione di barriera e la resilienza meccanica nei tessuti stratificati; sono stati inoltre riportati ruoli aggiuntivi nell’organizzazione del citoscheletro e nella segnalazione a livello delle giunzioni. Un’alterata espressione di PKP1 o una sua mislocalizzazione giunzionale possono compromettere l’assemblaggio dei desmosomi e la differenziazione epiteliale, contribuendo a fenotipi di fragilità cutanea e ad alterazioni dell’architettura tissutale. In quanto fattore associato ai desmosomi, PKP1 è ampiamente studiato nei percorsi che regolano l’adesione cellulare, la morfogenesi dei tessuti e le risposte allo stress epiteliale.

plakophilin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PKP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

plakophilin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PKP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PKP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di plakophilin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PKP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da plakophilin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via plakophilin 1 nelle cellule tumorali con espressione di PKP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.