PKAβ cat Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400649-ACT

PRKACB codifica a subunidade catalítica beta da proteína quinase A dependente de cAMP (PKAβcat), uma quinase central de serina/treonina que traduz sinais de cAMP em programas de fosforilação que controlam o metabolismo, a transcrição, a progressão do ciclo celular e a plasticidade sináptica. Após a elevação de cAMP induzida por GPCR, as subunidades catalíticas da PKA se dissociam das subunidades regulatórias para fosforilar substratos como o CREB e outros efetores da via, integrando sinais entre MAPK/ERK, a regulação de canais iónicos e a dinâmica mitocondrial. A atividade de PRKACB influencia a diferenciação celular e as respostas ao stress, e alterações na sinalização cAMP–PKA têm sido associadas a desregulação do controlo do crescimento e a fenótipos neurobiológicos em múltiplos contextos de doença. Como nó central na sinalização por cAMP, PRKACB é frequentemente estudado para dissecar a arquitetura da via, a regulação por feedback e os resultados transcricionais dependentes de fosforilação em células humanas.

PKAβ cat O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKACB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PKAβ cat O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKACB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKACB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PKAβ cat. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKACB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PKAβ cat no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PKAβ cat em células tumorais com expressão de PRKACB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.