PIPK II γ Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-409330

Descripción general

PIP4K2C codifica la fosfatidilinositol-5-fosfato 4-quinasa de tipo II gamma (PIPK II γ), una quinasa lipídica que fosforila PI5P para generar PI(4,5)P2, configurando los reservorios de fosfoinosítidos que coordinan el tráfico de membranas, la dinámica del citoesqueleto y la señalización asociada a receptores. Al modular la disponibilidad de PI(4,5)P2, PIPK II γ influye en vías downstream que dependen del reclutamiento de proteínas efectoras mediado por fosfoinosítidos, incluidos nodos que convergen con la señalización PI3K–AKT y la endocitosis regulada. La alteración del metabolismo de los fosfoinosítidos se asocia con proliferación desregulada, respuestas al estrés metabólico y señalización oncogénica en múltiples contextos, lo que convierte a PIP4K2C en una diana relevante para estudios mecanísticos de la homeostasis de la señalización. Sus funciones en membranas intracelulares también lo posicionan como un gen herramienta para investigar el control dependiente de fosfoinosítidos sobre la dinámica vesicular y la polarización celular.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO PIPK II γ (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen PIP4K2C en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus PIP4K2C, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR PIPK II γ (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido PIP4K2C.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido PIPK II γ CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto PIP4K2C.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus PIP4K2C y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones PIP4K2C críticos para la función PIPK II γ
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.