PI 3-kinase C2β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402519-ACT

PIK3C2B codifica la fosfatidilinositolo-4-fosfato 3-chinasi C2β (PI3K-C2β), una chinasi lipidica di classe II che genera segnali a base di fosfoinositidi importanti per la dinamica delle membrane e il traffico intracellulare. Attraverso la regolazione dei pool di fosfatidilinositolo 3-fosfato e fosfatidilinositolo (3,4)-bisfosfato, PI3K-C2β influenza l’endocitosi, il trasporto vescicolare, il rimodellamento del citoscheletro e, in modo dipendente dal contesto, gli output di segnalazione correlati a PI3K/AKT. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di PIK3C2B sono state associate a una deregolazione della segnalazione mediata dai fattori di crescita e a fenotipi invasivi in diversi modelli sperimentali di cancro; inoltre, il gene è studiato in vie collegate al metabolismo e alle risposte allo stress cellulare. Queste caratteristiche rendono PIK3C2B un bersaglio utile per analizzare il controllo, guidato dai fosfoinositidi, della segnalazione e dei processi associati alle membrane nelle cellule umane.

PI 3-kinase C2β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIK3C2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PI 3-kinase C2β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIK3C2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIK3C2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PI 3-kinase C2β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIK3C2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PI 3-kinase C2β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PI 3-kinase C2β nelle cellule tumorali con espressione di PIK3C2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.