Phox2b Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401351-ACT

PHOX2B codifica o fator de transcrição homeobox Phox2b, um regulador determinante de linhagem necessário para a especificação e manutenção de programas neuronais autonômicos e noradrenérgicos durante o desenvolvimento. O Phox2b coordena redes transcricionais que governam a diferenciação neuronal, a orientação axonal e a expressão de genes catecolaminérgicos, incluindo vias associadas a destinos celulares derivados da crista neural e a circuitos do tronco encefálico responsáveis pelo controle respiratório. Alterações genéticas ou expressão desregulada de PHOX2B estão ligadas a neurocristopatias e a tumores pediátricos da crista neural, incluindo a síndrome de hipoventilação central congênita e subgrupos de neuroblastoma. Essas características fazem de PHOX2B um nó central para estudar o controle transcricional do desenvolvimento do sistema nervoso autônomo e estados de diferenciação neural relevantes para doenças.

Phox2b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PHOX2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Phox2b O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PHOX2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PHOX2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Phox2b. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PHOX2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Phox2b no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Phox2b em células tumorais com expressão de PHOX2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.