Plásmido CRISPR de Activación (h) PDH-E1α: sc-401044-ACT

PDHA1 codifica la subunidad alfa E1 del complejo piruvato deshidrogenasa (PDH), un ensamblaje multienzimático mitocondrial que cataliza la descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil‑CoA, conectando la glucólisis con el ciclo del ácido tricarboxílico y la fosforilación oxidativa. La función de PDH‑E1α está estrechamente regulada por un control dependiente de la fosforilación de la actividad de la PDH, coordinando el flujo de carbono, el equilibrio redox y la producción de ATP en respuesta a la disponibilidad de nutrientes. La alteración de la expresión de PDHA1 o la disfunción del complejo PDH se asocia con reprogramación metabólica, deterioro de la respiración mitocondrial y fenotipos de acidosis láctica, con relevancia para la investigación de enfermedades neurometabólicas y mitocondriales. Como nodo central del metabolismo del carbono, PDHA1 se estudia con frecuencia en modelos de estrés oxidativo, respuesta a la hipoxia y adaptación bioenergética.

PDH-E1α El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PDHA1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PDH-E1α El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PDHA1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PDHA1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PDH-E1α. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PDHA1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PDH-E1α en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PDH-E1α en células tumorales con expresión de PDHA1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.