PDH-E1α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401044-ACT

PDHA1 codifica a subunidade E1 alfa do complexo piruvato desidrogenase (PDH), um conjunto multienzimático mitocondrial que catalisa a descarboxilação oxidativa do piruvato em acetil-CoA, conectando a glicólise ao ciclo do ácido tricarboxílico e à fosforilação oxidativa. A função da PDH-E1α é rigidamente regulada por um controle dependente de fosforilação da atividade da PDH, coordenando o fluxo de carbono, o balanço redox e a produção de ATP em resposta à disponibilidade de nutrientes. A expressão alterada de PDHA1 ou a disfunção do complexo PDH está associada à reprogramação metabólica, à respiração mitocondrial prejudicada e a fenótipos de acidose láctica, com relevância para pesquisas em doenças neurometabólicas e mitocondriais. Como um nó central do metabolismo do carbono, PDHA1 é frequentemente estudado em modelos de estresse oxidativo, resposta à hipóxia e adaptação bioenergética.

PDH-E1α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDHA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDH-E1α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDHA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDHA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDH-E1α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDHA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDH-E1α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDH-E1α em células tumorais com expressão de PDHA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.