Plásmido CRISPR de Activación (h) PDC-E2: sc-402520-ACT

El DLAT humano codifica PDC‑E2 (dihidrolipoamida acetiltransferasa), la subunidad central E2 del complejo mitocondrial piruvato deshidrogenasa, que canaliza el piruvato derivado de la glucólisis hacia el ciclo del TCA al generar acetil‑CoA. Esta enzima dependiente de lipoato sostiene el flujo central de carbono, el equilibrio redox y el metabolismo energético mitocondrial, y acopla funcionalmente la oxidación del piruvato con la capacidad respiratoria. La actividad de DLAT/PDC‑E2 se cruza con la detección de nutrientes y las respuestas al estrés oxidativo a través de su impacto en la producción de NADH y el transporte electrónico posterior. La desregulación de componentes del complejo piruvato deshidrogenasa se asocia con la remodelación metabólica observada en contextos de cáncer y neurodegeneración, y PDC‑E2 también es relevante para estudios de biología de autoantígenos mitocondriales.

PDC-E2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DLAT sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PDC-E2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DLAT en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DLAT, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PDC-E2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DLAT y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PDC-E2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PDC-E2 en células tumorales con expresión de DLAT silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.