PDC-E2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402520-ACT

Il gene umano **DLAT** codifica **PDC-E2** (diidrolipoamide acetiltransferasi), la subunità core **E2** del complesso mitocondriale della piruvato deidrogenasi, che convoglia nel ciclo del TCA il piruvato derivato dalla glicolisi generando **acetil‑CoA**. Questo enzima dipendente dal lipoato sostiene il flusso centrale del carbonio, l’equilibrio redox e il metabolismo energetico mitocondriale, accoppiando funzionalmente l’ossidazione del piruvato alla capacità respiratoria. L’attività di DLAT/PDC-E2 interseca i meccanismi di sensing dei nutrienti e le risposte allo stress ossidativo attraverso il suo impatto sulla produzione di **NADH** e sul conseguente trasporto di elettroni. La deregolazione dei componenti del complesso della piruvato deidrogenasi è associata al rimodellamento metabolico osservato in contesti oncologici e neurodegenerativi, e PDC-E2 è anche rilevante negli studi sulla biologia degli autoantigeni mitocondriali.

PDC-E2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DLAT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDC-E2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DLAT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DLAT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDC-E2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DLAT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDC-E2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDC-E2 nelle cellule tumorali con espressione di DLAT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.