PBGD Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420870-ACT

Hmbs nel topo codifica la porfobilinogeno deaminasi (PBGD), un enzima citosolico che catalizza la polimerizzazione di quattro molecole di porfobilinogeno per formare l’idrossimetilbilano, un intermedio centrale nella via di biosintesi dell’eme. Sostenendo la disponibilità di eme, la PBGD influenza la respirazione mitocondriale, la funzione dei citocromi e l’omeostasi redox, con effetti a valle sulla maturazione eritroide e sul metabolismo ossidativo cellulare. L’alterazione dell’attività di HMBS/PBGD è associata a un metabolismo delle porfirine disordinato e all’accumulo di intermedi a monte, rendendo questo gene un nodo chiave per modellare le risposte allo stress metabolico. Hmbs è quindi rilevante per studi sulla fisiologia epatica ed ematopoietica, sulla bioenergetica mitocondriale e sulla regolazione a livello di via della sintesi dei tetrapirroli.

PBGD Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hmbs senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PBGD Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hmbs nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hmbs, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PBGD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hmbs nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PBGD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PBGD nelle cellule tumorali con espressione di Hmbs silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.