PBEF Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425569-ACT

Nampt murino codifica PBEF (noto anche come visfatina), un enzima limitante della via di recupero (salvage) dell’NAD⁺ che converte la nicotinammide in nicotinammide mononucleotide, sostenendo così il metabolismo energetico cellulare e l’omeostasi redox. Controllando la disponibilità di NAD⁺, PBEF influenza la segnalazione dipendente da sirtuine e PARP, la funzione mitocondriale, la capacità di riparazione del DNA e le risposte allo stress. L’attività di Nampt/PBEF è strettamente legata alla regolazione immunometabolica, alla segnalazione infiammatoria e ai programmi di sopravvivenza cellulare che modellano le risposte nella disfunzione metabolica e nell’adattamento metabolico associato ai tumori. La disregolazione del metabolismo dell’NAD⁺ che coinvolge Nampt è stata studiata in contesti che includono resistenza all’insulina, stress bioenergetico rilevante per la neurodegenerazione e modelli di malattie proliferative in cui la richiesta di NAD⁺ è elevata.

PBEF Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nampt senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PBEF Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nampt nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nampt, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PBEF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nampt nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PBEF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PBEF nelle cellule tumorali con espressione di Nampt silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.