Plásmido CRISPR de Activación (h) PBEF: sc-416248-ACT

NAMPT, también conocido como PBEF, codifica la nicotinamida fosforribosiltransferasa, la enzima limitante de la velocidad en la vía de rescate de NAD que convierte la nicotinamida en mononucleótido de nicotinamida. Al controlar la disponibilidad intracelular de NAD, PBEF influye en la homeostasis redox y sostiene enzimas dependientes de NAD, incluidas las sirtuinas y las PARP, vinculando el estado metabólico con la regulación de la cromatina, la reparación del ADN y las respuestas al estrés. La actividad de NAMPT se cruza con la función mitocondrial, la señalización inflamatoria y el control del ciclo celular, y su desregulación se ha asociado con alteraciones del inmunometabolismo y la biología tumoral. Como nodo multifuncional del metabolismo del NAD, NAMPT se estudia con frecuencia en contextos de adaptación metabólica, estrés oxidativo y fenotipos celulares relacionados con la inflamación.

PBEF El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NAMPT sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PBEF El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NAMPT en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NAMPT, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PBEF. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NAMPT y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PBEF en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PBEF en células tumorales con expresión de NAMPT silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.