PBEF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416248-ACT

NAMPT, noto anche come PBEF, codifica la nicotinamide fosforibosiltransferasi, l’enzima limitante la velocità nella via di recupero (salvage) del NAD che converte la nicotinamide in nicotinamide mononucleotide. Controllando la disponibilità intracellulare di NAD, PBEF influenza l’omeostasi redox e sostiene enzimi NAD-dipendenti, tra cui sirtuine e PARP, collegando lo stato metabolico alla regolazione della cromatina, alla riparazione del DNA e alle risposte allo stress. L’attività di NAMPT interseca la funzione mitocondriale, la segnalazione infiammatoria e il controllo del ciclo cellulare, e la sua disregolazione è stata associata ad alterazioni dell’immunometabolismo e della biologia tumorale. In quanto nodo multifunzionale del metabolismo del NAD, NAMPT è spesso studiato in contesti di adattamento metabolico, stress ossidativo e fenotipi cellulari legati all’infiammazione.

PBEF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NAMPT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PBEF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NAMPT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NAMPT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PBEF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NAMPT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PBEF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PBEF nelle cellule tumorali con espressione di NAMPT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.