Plasmide CRISPR d'Activation (m) P2Y2: sc-422096-ACT

Le gène murin *P2ry2* code le récepteur purinergique P2Y2 (P2Y2R), un récepteur couplé aux protéines G activé par l’ATP et l’UTP extracellulaires, qui se couple principalement à Gq/11 pour stimuler la phospholipase C, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire et une signalisation dépendante de la PKC. P2Y2 engage également les voies MAPK/ERK et liées à la PI3K, et peut moduler le remodelage du cytosquelette et la migration liée aux intégrines, soutenant des rôles dans le transport épithélial, les réponses mécanotransductrices et le trafic leucocytaire. Dans les tissus immunitaires et de barrière, la signalisation P2Y2 contribue à la production de chimiokines et à des réponses au stress adjacentes à l’inflammasome, induites par les nucléotides libérés lors de lésions tissulaires. Une signalisation purinergique dérégulée impliquant P2Y2 a été étudiée dans les maladies pulmonaires inflammatoires, le remodelage chronique des voies aériennes, la douleur et la neuroinflammation, ainsi que la signalisation du microenvironnement associé aux tumeurs, faisant de *P2ry2* une cible utile pour l’exploration des voies et des phénotypes dans des modèles murins.

P2Y2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de P2ry2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

P2Y2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus P2ry2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription P2ry2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de P2Y2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus P2ry2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de P2Y2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie P2Y2 dans les cellules tumorales présentant une expression de P2ry2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.