P2X6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416264-ACT

O P2RX6 humano codifica a subunidade P2X6 dos canais iônicos P2X ativados por ATP, que mediam um rápido influxo de cátions em resposta a nucleotídeos extracelulares. O P2X6 pode contribuir para a formação de canais heteroméricos que moldam a sinalização dependente de Ca2+, a excitabilidade de membrana e programas transcricionais a jusante ligados à neurotransmissão purinérgica e à modulação imune. Por meio de redes de sinalização purinérgica, a atividade associada ao P2X6 pode influenciar processos como a homeostase do cálcio, a liberação vesicular e a integração de sinais inflamatórios. A detecção desregulada de ATP extracelular e a sinalização purinérgica ionotrópica têm sido implicadas na fisiopatologia neuroinflamatória e cardiovascular, o que motiva estudos mecanísticos sobre a regulação de P2RX6 em tipos celulares relevantes.

P2X6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de P2RX6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

P2X6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus P2RX6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição P2RX6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de P2X6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus P2RX6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de P2X6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via P2X6 em células tumorais com expressão de P2RX6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.