OAZ Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-430124-ACT

O Zfp423 de camundongo codifica o regulador transcricional multifator “multi–zinc finger” OAZ, uma proteína de ligação ao DNA que integra sinais do desenvolvimento para controlar a especificação de linhagens e programas de diferenciação. O OAZ participa de redes transcricionais ligadas à sinalização BMP/SMAD e interage com cofatores que modulam a expressão gênica neuronal e de adipócitos, influenciando decisões de destino celular e maturação. No sistema nervoso, o Zfp423 está implicado no desenvolvimento do cerebelo e no padrão de organização neuronal, enquanto em tecidos metabólicos contribui para a adipogênese e a homeostase energética. Assim, a desregulação de programas transcricionais associados ao Zfp423 é relevante para modelos de defeitos do neurodesenvolvimento e fenótipos metabólicos nos quais a diferenciação alterada e o “cross-talk” entre vias de sinalização são mecanismos centrais.

OAZ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Zfp423 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OAZ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Zfp423 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Zfp423, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OAZ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Zfp423 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OAZ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OAZ em células tumorais com expressão de Zfp423 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.