Plásmido CRISPR de Activación (m) Notch 3: sc-421933-ACT

Notch3 de ratón codifica el receptor Notch 3, un regulador transcripcional de paso único a través de la membrana que se activa mediante escisión proteolítica dependiente de ligando y la translocación nuclear del dominio intracelular de Notch. En las células de músculo liso vascular y los pericitos, la señalización de NOTCH3 ayuda a controlar decisiones de destino celular, la maduración y la estabilidad del vaso a través de la transcripción canónica mediada por RBPJ y el diálogo cruzado con vías como TGF-β, PDGFR y MAPK. La alteración de la actividad de Notch3 se asocia con programas de diferenciación desregulados y respuestas de remodelado en la biología cardiovascular y neurovascular, y también se estudia con frecuencia en contextos de plasticidad de linaje y redes de señalización de células tumorales. En consecuencia, Notch3 es una diana habitual para investigar la señalización del desarrollo, la comunicación célula–célula y las transiciones de estado transcripcional en sistemas de modelos murinos.

Notch 3 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Notch3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Notch 3 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Notch3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Notch3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Notch 3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Notch3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Notch 3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Notch 3 en células tumorales con expresión de Notch3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.