Notch 3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400424-ACT

NOTCH3 codifica o Notch 3, um receptor transmembranar de passagem única que medeia a sinalização Notch justácrina em resposta a ligantes do tipo Delta e Jagged. Após a ligação do ligante, o processamento proteolítico libera o domínio intracelular de Notch, que se transloca para o núcleo e coopera com RBPJ/CSL e coativadores para regular programas transcricionais que controlam a especificação do destino celular, a diferenciação e a homeostase tecidual. A atividade de Notch 3 está intimamente ligada à biologia das células musculares lisas vasculares e a redes mais amplas de sinalização do desenvolvimento, e a desregulação da transcrição dependente de NOTCH3 tem sido associada a arteriopatias hereditárias e a contextos oncogênicos. Como nó de via, o NOTCH3 fornece um modelo viável para dissecar a dinâmica de ativação do receptor, a saída transcricional e o crosstalk com processos relacionados a MAPK, PI3K-AKT e TGF-β.

Notch 3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NOTCH3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Notch 3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NOTCH3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NOTCH3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Notch 3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NOTCH3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Notch 3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Notch 3 em células tumorais com expressão de NOTCH3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.