NNT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402908-ACT

A NNT (transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida) humana é uma enzima da membrana interna mitocondrial que acopla a força protomotriz à transferência de equivalentes redutores entre NAD(H) e NADP(H), mantendo os reservatórios mitocondriais de NADPH. Ao sustentar sistemas antioxidantes dependentes de glutationa e tioredoxina, a NNT ajuda a controlar as espécies reativas de oxigênio e a preservar a homeostase redox durante a fosforilação oxidativa e o estresse metabólico. A atividade da NNT influencia a respiração mitocondrial, a esteroidogênese e a sinalização metabólica mais ampla por meio de seu impacto em vias biossintéticas e de desintoxicação dependentes de NADPH. Alterações na função da NNT têm sido associadas a desequilíbrio redox mitocondrial e vêm sendo estudadas em contextos que incluem disfunção metabólica e distúrbios ligados a uma capacidade reduzida de tamponamento do estresse oxidativo.

NNT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NNT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NNT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NNT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NNT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NNT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NNT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NNT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NNT em células tumorais com expressão de NNT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.