NHE-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401420-ACT

SLC9A3 codifica o trocador apical de Na+/H+ NHE-3, um importante regulador da absorção eletroneutra de sódio e da homeostase do pH intracelular em células epiteliais. A atividade do NHE-3 integra-se a redes de transporte iónico que coordenam o equilíbrio hídrico, o manuseamento de bicarbonato e a função dos microvilos, sendo controlada dinamicamente por tráfego intracelular e fosforilação a jusante de cAMP/PKA, PKC e de complexos de ancoragem associados a NHERF/ezrina. No intestino e no rim, o NHE-3 ajuda a acoplar a captação de sódio a processos de transporte de nutrientes e de equilíbrio ácido–base, moldando o movimento transepitelial de NaCl e de água. Alterações na expressão ou na regulação de SLC9A3 têm sido associadas a disfunção do transporte epitelial relevante para fenótipos de diarreia/obstipação, contextos de sinalização inflamatória e perturbações renais no manuseamento de sal.

NHE-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC9A3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NHE-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC9A3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC9A3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NHE-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC9A3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NHE-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NHE-3 em células tumorais com expressão de SLC9A3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.