Plásmido CRISPR de Activación (h) NHE-3: sc-401420-ACT

SLC9A3 codifica el intercambiador apical Na+/H+ NHE-3, un regulador principal de la absorción electroneutra de sodio y de la homeostasis del pH intracelular en células epiteliales. La actividad de NHE-3 se integra en redes de transporte iónico que coordinan el equilibrio de fluidos, el manejo de bicarbonato y la función de las microvellosidades, y se controla dinámicamente mediante tráfico intracelular y fosforilación aguas abajo de cAMP/PKA, PKC y complejos de andamiaje asociados a NHERF/ezrina. En el intestino y el riñón, NHE-3 ayuda a acoplar la captación de sodio a procesos de transporte de nutrientes y del equilibrio ácido-base, modulando el movimiento transepitelial de NaCl y agua. Las alteraciones en la expresión o regulación de SLC9A3 se han relacionado con disfunción del transporte epitelial relevante para fenotipos de diarrea/estreñimiento, contextos de señalización inflamatoria y trastornos renales en el manejo de sal.

NHE-3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC9A3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NHE-3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC9A3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC9A3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NHE-3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC9A3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NHE-3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NHE-3 en células tumorales con expresión de SLC9A3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.