netrin-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403229-ACT

Il gene umano **NTN4** codifica la netrina-4, un segnale di guida secreto correlato alle laminine, arricchito nelle membrane basali, che modula l’adesione cellulare, la migrazione e l’organizzazione dei tessuti. La netrina-4 interagisce con recettori e componenti della matrice extracellulare per influenzare i programmi di guida assonale, la morfogenesi vascolare e le interazioni epitelio–endotelio, con effetti a valle sul rimodellamento del citoscheletro e sull’organizzazione della matrice extracellulare. Nel sistema vascolare e in quello nervoso, alterazioni dell’espressione di **NTN4** sono state associate a una deregolazione dei segnali angiogenici, delle proprietà di barriera e dei processi di rimodellamento, rilevanti per anomalie dello sviluppo e meccanismi patogenetici complessi.

netrin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NTN4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

netrin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NTN4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NTN4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di netrin-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NTN4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da netrin-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via netrin-4 nelle cellule tumorali con espressione di NTN4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.