Net Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405945-ACT

ELK3 (Net) é um fator de transcrição com domínio ETS que atua predominantemente como represssor transcricional e como ativador dependente do contexto a jusante da sinalização RAS–RAF–MEK–ERK. Ao formar complexos ternários com o fator de resposta ao soro (SRF) em elementos de resposta ao soro, o Net integra sinais mitogênicos e de estresse para regular programas de genes de resposta imediata, remodelamento do citoesqueleto e transições de estado celular. A atividade do Net influencia processos como a biologia endotelial, migração e invasão por meio da regulação de genes-alvo ligados a saídas transcricionais dirigidas por MAPK. A desregulação da expressão ou da sinalização de ELK3 tem sido associada a programas oncogênicos, fenótipos relacionados à angiogênese e potencial metastático, tornando-o um nó relevante para estudos mecanísticos da progressão tumoral e do remodelamento vascular.

Net O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ELK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Net O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ELK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ELK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Net. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ELK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Net no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Net em células tumorais com expressão de ELK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.