Na⁺ CP type Vα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402162-ACT

SCN5A codifica la subunità α che forma il poro del canale del sodio voltaggio-dipendente Na⁺ CP di tipo Vα (NaV1.5), un determinante chiave della depolarizzazione rapida e dell’inizio del potenziale d’azione nelle cellule eccitabili. Mediando correnti entranti di Na⁺, NaV1.5 regola l’eccitabilità di membrana, la velocità di conduzione e l’accoppiamento dell’attività elettrica con i processi a valle di gestione del Ca²⁺ e di eccitazione–contrazione. La funzione di SCN5A si integra con reti di omeostasi ionica e vie di segnalazione che influenzano il traffico del canale, il gating dipendente dalla fosforilazione e il rimodellamento elettrico in risposta allo stress. Alterazioni genetiche e regolatorie di SCN5A sono associate a una suscettibilità alle aritmie sia ereditarie sia acquisite, rendendolo un bersaglio centrale per studi meccanicistici sulla dinamica della corrente del sodio e su fenotipi legati all’elettrofisiologia.

Na+ CP type Vα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCN5A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Na+ CP type Vα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCN5A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCN5A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Na+ CP type Vα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCN5A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Na+ CP type Vα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Na+ CP type Vα nelle cellule tumorali con espressione di SCN5A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.