NALCN Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403432-ACT

NALCN codifica a proteína do canal de fuga de sódio não seletivo, um componente de membrana formador de poro que medeia uma condutância basal de Na+ independente de voltagem e ajuda a estabelecer o potencial de membrana de repouso e a excitabilidade intrínseca em neurônios e outras células excitáveis. Ao ajustar o impulso despolarizante basal, a função de NALCN se cruza com redes de sinalização que regulam o disparo rítmico, a integração sináptica e o controle homeostático do potencial de membrana. A atividade ou a expressão desregulada de NALCN tem sido associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e neuromotores, incluindo ritmo respiratório alterado e hipotonia, refletindo seu papel na função de circuitos dependente de excitabilidade. Em modelos celulares humanos, a modulação de NALCN oferece uma ferramenta viável para estudar a eletrofisiologia de membrana, a regulação de canais iônicos e respostas transcricionais a jusante a alterações na excitabilidade.

NALCN O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NALCN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NALCN O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NALCN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NALCN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NALCN. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NALCN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NALCN no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NALCN em células tumorais com expressão de NALCN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.