Plásmido CRISPR de Activación (h) NALCN: sc-403432-ACT

NALCN codifica la proteína del canal de fuga de sodio no selectivo, un componente de membrana formador de poros que media una conductancia basal de Na+ independiente del voltaje y ayuda a establecer el potencial de membrana en reposo y la excitabilidad intrínseca en neuronas y otras células excitables. Al ajustar el impulso despolarizante basal, la función de NALCN se integra con redes de señalización que regulan el disparo rítmico, la integración sináptica y el control homeostático del potencial de membrana. La actividad o expresión desregulada de NALCN se ha vinculado a fenotipos del neurodesarrollo y neuromotores, incluidos trastornos del ritmo respiratorio e hipotonía, lo que refleja su papel en la función de circuitos dependiente de la excitabilidad. En modelos celulares humanos, la modulación de NALCN ofrece una herramienta manejable para estudiar la electrofisiología de membrana, la regulación de canales iónicos y las respuestas transcripcionales aguas abajo ante cambios en la excitabilidad.

NALCN El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NALCN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NALCN El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NALCN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NALCN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NALCN. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NALCN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NALCN en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NALCN en células tumorales con expresión de NALCN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.