Mitofilin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403617-ACT

Das humane IMMT-Gen kodiert Mitofilin, ein essenzielles Gerüstprotein der inneren Mitochondrienmembran und eine Kernkomponente des MICOS-Komplexes (mitochondrial contact site and cristae organizing system). Mitofilin koordiniert die Bildung von Crista-Junctions, stabilisiert die Organisation der Atmungskette und unterstützt den mitochondrialen Proteinimport sowie den Lipidtransport an Kontaktstellen zwischen den Membranen. Damit verknüpft es die mitochondriale Architektur mit oxidativer Phosphorylierung und metabolischer Homöostase. Eine Störung der IMMT-abhängigen Cristae-Struktur ist mit veränderter mitochondrialer Dynamik, beeinträchtigter Bioenergetik und erhöhter Anfälligkeit für zelluläre Stressantworten assoziiert. IMMT wurde im Zusammenhang mit Erkrankungen untersucht, die durch mitochondriale Dysfunktion gekennzeichnet sind, darunter neurodegenerative und kardiometabolische Krankheitsbilder, bei denen Cristae-Remodelling Signalwege und Zellüberleben beeinflussen kann.

Mitofilin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IMMT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mitofilin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IMMT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IMMT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mitofilin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IMMT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mitofilin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mitofilin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IMMT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.